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化學(xué)性質(zhì)

結(jié)構(gòu)

具有明確的化學(xué)結(jié)構(gòu)，其合成方法應(yīng)該是可復(fù)制的。避免常見(jiàn)的毒性部分和pan試驗(yàn)干擾部分(PAINS)。同樣避免化學(xué)反應(yīng)基團(tuán)，除非需要，例如共價(jià)加成。

穩(wěn)定性

應(yīng)在相關(guān)介質(zhì)中保持穩(wěn)定性（純度和化學(xué)特性），并注意pH敏感性。活動(dòng)應(yīng)保留在文化媒體。分子不應(yīng)表現(xiàn)出非特異性的化學(xué)反應(yīng)性（例如，氧化還原反應(yīng)或膜不穩(wěn)定）。

溶解度

在水介質(zhì)中的溶解度應(yīng)足夠（例如，IC50的10倍或低% DMSO中的0.05 μg/ml）。溶解度和親脂性都需要平衡。高電荷，高可溶性化合物可能顯示低細(xì)胞或組織滲透性。疏水化合物可能表現(xiàn)出高滲透性和效力，同時(shí)存在溶解度問(wèn)題。使用鹽形式的疏水分子應(yīng)提高水溶解度。

滲透性

通過(guò)被動(dòng)或主動(dòng)運(yùn)輸?shù)臐B透性對(duì)于細(xì)胞活性是必不可少的。血腦屏障穿透對(duì)于預(yù)期的中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)效果很重要。Caco-2細(xì)胞滲透性測(cè)定或平行人工膜滲透性測(cè)定(PAMPAs)是評(píng)估被動(dòng)擴(kuò)散的常用測(cè)定方法。MDCK-MDR1滲透性可用于評(píng)估中樞神經(jīng)系統(tǒng)滲透，包括p -糖蛋白(PGP)的主動(dòng)外排。

效價(jià)

IC50 和 Ki

IC50和Ki是表示抑制劑效力的最常用方法。在酶抑制的背景下，IC50表示在給定的實(shí)驗(yàn)條件下將酶反應(yīng)速率降低50%所需的抑制劑的濃度。Ki表示抑制劑-目標(biāo)復(fù)合物分解(koff)與抑制劑-目標(biāo)復(fù)合物形成(kon)的比值，用于抑制劑與酶的結(jié)合。術(shù)語(yǔ)Ki是一個(gè)熱力學(xué)平衡常數(shù)，因此是一個(gè)固定值。另一方面，IC50是在一組確定的條件下的抑制作用的表示，并將根據(jù)反應(yīng)環(huán)境中存在的底物濃度等因素而變化。對(duì)于競(jìng)爭(zhēng)抑制劑，IC50可以通過(guò)Cheng-Prusoff方程與Ki相關(guān):IC50=Ki*(1+[S]0/Km)。這是一個(gè)有用的基于網(wǎng)絡(luò)的工具，可以使用不同的抑制劑結(jié)合模型將IC50值轉(zhuǎn)換為Ki值。

注意，對(duì)于酶以外的蛋白質(zhì)（如G蛋白偶聯(lián)受體或離子通道），拮抗劑的功效也可以通過(guò)Ki或IC50來(lái)報(bào)告。在GPCRs的情況下，IC50（或通常EC50）是細(xì)胞反應(yīng)抑制的指示（即cAMP濃度的降低），而Ki僅指與天然配體結(jié)合在受體上。

體外試驗(yàn)

體外藥效基準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)通常為IC50或Ki值在生化測(cè)定中為100 nM，在細(xì)胞測(cè)定中為1-10 μM。酶測(cè)定的效力應(yīng)與細(xì)胞中的效力相關(guān)。使用盡可能低的濃度，以避免脫靶效應(yīng)。僅在濃度為10 μM時(shí)對(duì)細(xì)胞有效的抑制劑可能是非特異性靶向蛋白質(zhì)。

體內(nèi)試驗(yàn)

體內(nèi)效力基準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)達(dá)到目標(biāo)組織中與細(xì)胞效力相關(guān)的水平。必須注意與化合物的吸收、溶解、代謝或排泄有關(guān)的影響。代謝穩(wěn)定性是關(guān)鍵問(wèn)題，如果該化合物將推進(jìn)動(dòng)物研究。

濃度依賴性

當(dāng)使用低到高范圍的推薦濃度進(jìn)行實(shí)驗(yàn)時(shí)，劑量依賴性活性應(yīng)很明顯。在飽和濃度下對(duì)目標(biāo)的近乎完全抑制證實(shí)了該化合物的功效。

構(gòu)效關(guān)系

構(gòu)效關(guān)系(SAR)分析可以解釋一系列具有不同活性的化合物與一種酶或受體的結(jié)合，從而了解目標(biāo)蛋白結(jié)合的要求、允許量和限制。SAR系列覆蓋3-4個(gè)效能數(shù)量級(jí)是很重要的。一個(gè)“平坦”的合成孔徑(SAR)，即包含巨大結(jié)構(gòu)差異的整個(gè)系列化合物都具有近乎等效的弱效力，可以表明給目標(biāo)下藥的難度增加。

可選擇性

數(shù)據(jù)剖析

分析將定義對(duì)相關(guān)目標(biāo)的選擇性，這通常是一個(gè)比效力更關(guān)鍵的因素。通常情況下，在生化分析中，靶標(biāo)的效力比其他家族成員強(qiáng)10-100倍的因素定義了一種抑制劑對(duì)該靶標(biāo)的選擇性。針對(duì)你感興趣的目標(biāo)設(shè)計(jì)的選擇性抑制劑仍然可以在更高濃度下結(jié)合其他蛋白質(zhì)。重要的是要了解任何與特定化學(xué)類相關(guān)的額外活動(dòng)。

陰性對(duì)照

可以設(shè)計(jì)陰性對(duì)照實(shí)驗(yàn)，以證明該抑制劑在用于抑制所需靶標(biāo)的濃度下，不會(huì)有效地改變?nèi)魏蚊摪械鞍椎墓δ堋＝?jīng)過(guò)充分考慮的陰性對(duì)照，如僅將細(xì)胞或蛋白質(zhì)暴露于溶劑或替換密切相關(guān)的非活性結(jié)構(gòu)類似物，如R/S立體異構(gòu)體，有助于確認(rèn)抑制劑的效果。

陽(yáng)性對(duì)照

陽(yáng)性對(duì)照實(shí)驗(yàn)可用于證明在效果不明顯的情況下，抑制劑的行為符合預(yù)期。對(duì)照組不接受實(shí)驗(yàn)治療，而是接受已知能產(chǎn)生預(yù)期效果的其他治療。

正交探測(cè)器

具有相似活性但來(lái)自不同化學(xué)型和/或作用方式的正交探針也可考慮用作附加對(duì)照。如果正交探針產(chǎn)生類似的反應(yīng)，則更有可能是對(duì)靶標(biāo)的抑制導(dǎo)致了所觀察到的表型。如果沒(méi)有，那么混淆脫靶或毒性作用可能是由抑制劑引起的。

使用環(huán)境

作用機(jī)理

作用機(jī)制對(duì)于進(jìn)一步定義抑制劑的性質(zhì)非常重要，以便確定天然底物在生理濃度下如何調(diào)節(jié)抑制劑的功效，并確定與該機(jī)制相關(guān)的任何漏洞。潛在的抑制事件包括:

不可逆抑制-抑制劑

不可逆抑制-抑制劑通常通過(guò)共價(jià)附著結(jié)合酶，不可逆地使酶失活。雖然不可逆抑制劑通常是共價(jià)的，但非共價(jià)抑制劑有時(shí)可以很長(zhǎng)時(shí)間地發(fā)揮不可逆抑制劑的作用。

可逆抑制劑

●   可逆抑制可以分解為以下幾種:

●   競(jìng)爭(zhēng)抑制-抑制劑和底物競(jìng)爭(zhēng)自由酶，但每一個(gè)都阻礙了對(duì)方的結(jié)合，因?yàn)檫@種結(jié)合事件通常發(fā)生在目標(biāo)的活性位點(diǎn)(正位位點(diǎn))，正是底物也結(jié)合的地方。

●   非競(jìng)爭(zhēng)性抑制-抑制劑與游離酶和酶-底物復(fù)合物結(jié)合得同樣好。雖然非競(jìng)爭(zhēng)性抑制通常發(fā)生在變構(gòu)位點(diǎn)，但非競(jìng)爭(zhēng)性抑制也可以在結(jié)合正構(gòu)位點(diǎn)時(shí)發(fā)生，通常在活性位點(diǎn)是雙底物位點(diǎn)的情況下(酶與一種底物競(jìng)爭(zhēng)，但與另一種底物不競(jìng)爭(zhēng))。

●   非競(jìng)爭(zhēng)性抑制-抑制劑只能與酶-底物復(fù)合物結(jié)合，形成無(wú)活性的可逆三元復(fù)合物。非競(jìng)爭(zhēng)性抑制是混合抑制的一種特殊情況。

●   混合抑制-抑制劑與酶的結(jié)合在自由酶和酶-底物復(fù)合物中不同。這種類型的抑制劑可能表現(xiàn)出對(duì)一種狀態(tài)(非競(jìng)爭(zhēng)性抑制)或另一種狀態(tài)(競(jìng)爭(zhēng)性抑制)的更大親和力。

●   變構(gòu)抑制-抑制劑結(jié)合到靶上的變構(gòu)位點(diǎn)而不是活性位點(diǎn)，引起靶酶的構(gòu)象變化，這是抑制所必需的。這些構(gòu)象變化會(huì)影響通常酶-底物活性位點(diǎn)復(fù)合物的形成，破壞過(guò)渡態(tài)的穩(wěn)定，或降低降低催化活化能的能力。

●   部分抑制-酶-底物-抑制劑相互作用產(chǎn)生的復(fù)合物比酶-底物復(fù)合物的周轉(zhuǎn)率低。部分活性仍然存在，因?yàn)槊?底物-抑制劑復(fù)合物的催化中心可能保留一些在底物附近排列和促進(jìn)催化的能力。

●   緊密結(jié)合抑制-最初的酶抑制劑復(fù)合物經(jīng)歷異構(gòu)化形成第二個(gè)更緊密的復(fù)合物。緊密結(jié)合抑制劑傾向于顯示非競(jìng)爭(zhēng)性表型，即使它們可以以競(jìng)爭(zhēng)性、非競(jìng)爭(zhēng)性或非競(jìng)爭(zhēng)性的方式與目標(biāo)酶結(jié)合。因?yàn)檫@可以表現(xiàn)為緩慢增加的酶抑制，這是時(shí)間依賴的，傳統(tǒng)的Michaelis-Menten動(dòng)力學(xué)將給出一個(gè)錯(cuò)誤的Ki值。通過(guò)分析kon和koff速率常數(shù)，可以得到更真實(shí)的Ki值。

●   時(shí)間依賴性抑制-抑制劑在酶周轉(zhuǎn)的時(shí)間尺度上緩慢地與酶結(jié)合，這具有減緩觀察到的抑制發(fā)作的效果。這可能導(dǎo)致催化劑速率常數(shù)(kcat)值變慢。

抑制物-靶點(diǎn)動(dòng)力學(xué)

抑制物-靶點(diǎn)動(dòng)力學(xué)，包括kon、停留時(shí)間和koff，為化合物的效力和選擇性增加了額外的維度。與靶標(biāo)緩慢解離的化合物在較低濃度時(shí)可能具有較長(zhǎng)的活性，從而使劑量水平或劑量頻率降低。通常停留時(shí)間比熱力學(xué)效力更能與體內(nèi)活性相關(guān)。

靶標(biāo)易損性

目標(biāo)脆弱性是觀察到效果所需的目標(biāo)參與的最低水平的函數(shù)。高易損性靶標(biāo)需要較低水平的靶標(biāo)占用(即較低水平的抑制劑暴露)才能達(dá)到預(yù)期效果。以細(xì)胞為基礎(chǔ)的沖洗實(shí)驗(yàn)可以通過(guò)幫助確定一旦抑制劑從系統(tǒng)中移除，目標(biāo)接觸的表型后果，從而提供對(duì)目標(biāo)脆弱性的深入了解。

生理環(huán)境

必須考慮目標(biāo)的生理環(huán)境和目標(biāo)交戰(zhàn)的下游后果。例如，與該途徑中的其他酶相比，破壞一種催化代謝途徑中限速步驟的酶可能會(huì)產(chǎn)生更大的后果。在抗菌或抗癌的背景下，抑制生化途徑的最后步驟，高能量/高成本生化產(chǎn)品的下游，可能被證明對(duì)目標(biāo)細(xì)胞特別有毒。

時(shí)間范圍

在設(shè)計(jì)試驗(yàn)時(shí)，應(yīng)考慮預(yù)期表型效應(yīng)或觸發(fā)信號(hào)事件級(jí)聯(lián)所需的時(shí)間范圍，以相應(yīng)地捕獲這一時(shí)間長(zhǎng)度。

補(bǔ)充實(shí)驗(yàn)

使用可用的RNAi或突變體的互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)，在可用時(shí)，有助于就生物系統(tǒng)中給定目標(biāo)的作用建立共識(shí)。

適應(yīng)性

化合物對(duì)目標(biāo)的應(yīng)用適應(yīng)性最終取決于它與所研究假設(shè)的生物學(xué)背景的聯(lián)系程度，因?yàn)樵谝粋€(gè)生物系統(tǒng)中使用抑制劑不一定能推斷出另一個(gè)生物系統(tǒng)。一種適合目的的抑制劑既適用于靶標(biāo)，也適用于更廣泛的科學(xué)背景。

可得性

該化合物的可用性是廣泛的，并且可以獲得后續(xù)使用的數(shù)量。